学术文章丨多重微流控数字PCR技术赋能肺炎支原体感染精准诊疗

发布日期：2025-12-26

近日，首都医科大学附属首都儿童医学中心、首都儿科研究所袁静团队，在国际期刊《Microchimica Acta》上发表题为“A one-pot, visual, multiplex microfluidic digital PCR chip for simultaneous point-of-care detection, genotyping, and macrolide resistance assessment of Mycoplasma pneumoniae”的研究论文。团队针对肺炎支原体临床诊断中“检测、分型、耐药评估无法同步完成”的核心痛点，基于新羿数字PCR平台，开发了一种单管可视化多重微流控数字PCR    (MMDPCR, multiplex microfluidic digital polymerase chain reaction)检测方法，利用四种荧光探针，为肺炎支原体感染的快速诊断、菌株分型及大环内酯类耐药评估提供高灵敏、高特异的即时检测工具，助力儿童呼吸道感染精准诊疗与公共卫生监测。

研究背景

肺炎支原体（M. pneumoniae）是社区获得性肺炎的主要致病菌，尤其易侵袭儿童群体，可通过呼吸道飞沫传播，潜伏期1-3周，易引发聚集性暴发。全球范围内，肺炎支原体可导致10%-40%的社区获得性肺炎病例，2023年我国北方地区秋冬季感染率较2022年同期上升40%，欧美地区也出现感染病例激增态势。

临床治疗中，大环内酯类抗生素是儿童肺炎支原体感染的一线用药，但近年疫情期间其耐药率已高达99%；同时肺炎支原体P1基因型与临床表型相关既往文献报道，Ⅱ型菌株毒力更强易引发重症，Ⅰ型菌株则常与更高耐药率相关。传统检测手段存在明显局限：常规PCR难以实现绝对定量，实时荧光定量PCR（qPCR）低浓度样本检出率有限，无法同步完成感染确认、基因型鉴定与耐药评估，因此亟需建立一体化的高精准检测方法。

研究目的

建立一站式MMDPCR检测体系，实现肺炎支原体“感染检测+菌株分型+耐药评估”同步完成：

• 筛选肺炎支原体Ⅰ型特异Mpn137基因、Ⅱ型特异F539基因及大环内酯类耐药关键A2063G突变位点，设计专属引物探针；

• 优化MMDPCR反应条件（退火温度、引物探针浓度），构建四通道荧光检测体系；
• 验证方法的灵敏度、特异性及临床适用性，为临床诊疗和流行病学监测提供技术支撑。

研究方法

研究团队选取2株肺炎支原体标准株及2株临床分离株，同时纳入12种常见呼吸道病原体（流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌等）用于特异性验证；收集2023-2024年北京地区192份疑似肺炎支原体感染临床样本，采用建立的MMDPCR体系与qPCR方法平行检测以验证临床效能。

研究结果

※ 反应条件优化结果

最优30μL MMDPCR体系为：6μL PCR Supermix A、1.5μL PCR Supermix B、终浓度500nM的上下游引物各1.5μL、终浓度250nM的探针各0.75μL、2μL模板DNA。扩增程序为95℃预变性10min→40个循环（94℃变性30s+58℃退火/延伸1min）→12℃冷却5min。此条件下，四通道荧光信号分离效果最优，阳性/阴性微滴无交叉干扰，扩增效率达峰值（见图1）。

图1

※ 灵敏度：最低可检出10-100拷贝核酸

对肺炎支原体Ⅰ型、Ⅱ型、大环内酯敏感株及耐药株的系列稀释DNA检测显示，该方法最低检出限为10-100拷贝/反应，其中Ⅰ型最低可检出23.9拷贝、Ⅱ型29.7拷贝、敏感株20.8拷贝、耐药株34.5拷贝；各靶标标准曲线R²均＞0.994，实测拷贝数与理论值高度吻合，定量准确性优异（见图2）。

图2

※ 特异性：无交叉反应

对12种非肺炎支原体呼吸道病原体的检测结果均为阴性，仅肺炎支原体Ⅰ型标准株M129可检出FAM通道阳性信号（拷贝数77283.3）、Ⅱ型标准株FH可检出VIC通道阳性信号（拷贝数172949.9），证明引物探针特异性100%（见图3）。

图3

※ 临床样本检测：阳性率56.25%，耐药率高达99%

192份临床样本中，MMDPCR检出阳性样本108份，阳性率56.25%，与qPCR结果100%一致；基因型分布上Ⅰ型占75.9%（82/108）、Ⅱ型占24.1%（26/108）；大环内酯类耐药检测显示99.1%（107/108）样本携带A2063G耐药突变，且耐药株以Ⅰ型为主，仅1份Ⅱ型样本为敏感株（见图4）。

图4

总结与讨论

综上，本研究建立的MMDPCR检测方法，可在1.5小时内同步完成肺炎支原体感染确认、P1基因型鉴定及大环内酯类耐药评估，兼具高灵敏度、高特异性与绝对定量能力。临床验证显示其能精准识别流行菌株特征，为临床合理使用抗生素、评估治疗效果提供关键依据，同时可为肺炎支原体分子流行病学监测、聚集性疫情溯源提供技术支撑。

原文链接：

https://doi.org/10.1007/s00604-025-07666-0

●关于新羿生物●

新羿生物成立于2015年，位于中关村科技园，是国家高新技术企业、北京市“专精特新”企业，专注于生命科学与分子诊断的自主创新，拥有在仪器、芯片、材料、试剂、软件等领域的高水平研发团队。公司发展迅速，申请国内外专利200余项、授权专利150余项，持续在权威期刊发表学术论文，承担国家级科研基金。公司基于自主知识产权的数字PCR技术，已获得首个及第二个共三项数字PCR仪NMPA III类医疗器械注册证，三项诊断试剂NMPA III类医疗器械注册证，其中感染和实体瘤液体活检领域均为首个数字PCR诊断试剂III类注册证，两次获得中国体外诊断优秀创新产品金奖，荣获中关村国际前沿科技创新大赛总冠军，荣获北京市科学技术二等奖和发明创业成果奖。公司自主研发的开放式分子POCT一体机及qPCR快检试剂均获NMPA III类医疗器械注册证。公司秉承“创新，让精准触手可及”的理念，发展多指标、高通量、自动化、防污染、成本低的先进技术，致力于成为领先的生命科学和分子诊断企业，服务于生命科学、精准医疗、药物开发及健康管理。