新羿数字PCR | 基于重复片段用于无创产前检测的关键方法

2021年8月12日，厦门大学生命科学学院、分子诊断教育部工程研究中心李庆阁教授团队与厦门大学健康医疗大数据国家研究院、苏州市立医院合作发表研究型文章于EBioMedicine（IF 8.14）期刊。文章围绕人类染色体非整倍体检测的生物标记物——重复片段（segmental duplication, SD）开发了计算程序ChAPDes筛选靶点，使用多色探针熔解曲线技术和数字PCR技术进行染色体非整倍体检测及临床队列研究；其中，新羿生物数字PCR技术平台在评估SD片段和验证无创产前检测方法学中起到关键作用。

研究背景

胎儿染色体非整倍体的产前诊断对于妊娠管理和遗传咨询至关重要，临床上目前应用于染色体非整倍体异常检测的技术主要分为细胞遗传学和分子遗传学两大类，如核型分析、荧光原位杂交、染色体微阵列芯片、QF-PCR及MLPA等。近年来，许多研究致力于开发非侵入性产前检测方法，其性能优于孕期血清筛查，能够减轻孕妇侵入性检查的痛苦，降低流产或感染的风险。

基于二代测序技术（NGS）的无创产前检测（NIPT）已广泛应用于产前诊断，包括检测胎儿13、18、21三体以及性染色体非整倍体异常、亚染色体缺失和重复等疾病类型。然而，该方法也存在检测周期长、耗材成本高、操作流程复杂等缺点。

基于PCR的染色体非整倍体分子检测方法，主要通过分析待测染色体与参考染色体的相对剂量（relative chromosome dosage, RCD）来鉴别疾病类型。本研究提出一种通用的、潜在的生物标记物SD片段可用于染色体非整倍体检测，使用一对共用引物进行扩增，从而消除扩增偏差并提高定量结果的可靠性。

图1：研究工作流程

研究方法

本研究基于新羿生物的微滴式数字PCR，提出了创新NIPT方案，经预富集后进行8个数字PCR反应的集成检测（5万级别微液滴每反应），并验证了该方法用于无创产前检测染色体非整倍体异常的可行性。

图2：新羿生物数字PCR技术平台使用情况

研究结果

在方法学建立和体系验证部分，首先，基于实时荧光PCR的多色熔解曲线技术（MMCA）建立两管PCR反应体系，可同时检测多种染色体非整倍体异常，如：47,XX(XY)+13、47,XX(XY)+18、47,XX(XY)+21、45/X、47/XXX、47/XXY、47/XYY等；对333份羊水细胞样本和130份绒毛组织样本进行临床验证和队列研究，总共检测到53份常染色体非整倍体异常和37份性染色体非整倍异常，总体特异性为99.64%，灵敏度为100%；其中，检测到三份假阳性样本通过数字PCR方法验证为阴性样本，通过对比不同提取方式的基因组样本检测结果，数字PCR方法显示出更好的耐受性、稳定性和精密度。

图3：数字PCR方法检测染色体非整倍体

根据泊松分布的数学模型，分析数字PCR方法的精密度的动态范围与微滴数、胎儿含量的关系可知，通过增加阳性微滴数能够提升检测结果的准确性。收集孕周为14~20周的NIPT样本进行临床评价，使用基于数字PCR方法进行21三体综合征的无创检测和双盲分析，检测结果与NGS完全一致。

图4：数字PCR方法用于NIPT的理论模型分析与临床评价

研究意义

本研究证实SD片段可作为人类染色体非整倍体检测的首选生物标记物，为大规模产前诊断提供了新的途径。结合数字PCR技术，类似的检测策略也可用于诊断其他染色体数目异常和遗传疾病。

作者介绍

厦门大学生命科学学院博士生陈昕雯、厦门大学信息学院博士生李一凡为该研究的第一作者，苏州市立医院生殖遗传中心王挺主任、厦门大学生命科学学院纪志梁教授、厦门大学分子诊断教育部工程研究中心李庆阁教授为该研究的共同通讯作者。

原文链接：

DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103535