制药应用 | 数字PCR检测生物药酵母细胞残留DNA

酵母细胞特别是毕赤酵母，是目前生产蛋白质类药物的常用宿主细胞。宿主细胞残留的DNA是生产工艺过程中的杂质，须对药物纯化工艺后的残留DNA进行监测和去除，以确保药物的纯度和安全性。目前，基于荧光定量PCR（qPCR）的方法被广泛应用于宿主细胞残留DNA的定量检测。数字PCR（dPCR）技术在这个领域的应用也在不断发展，它比qPCR具有更高的灵敏度和绝对定量能力。与qPCR相比，用dPCR方法可以从大量药物中检测到含量更低的酵母细胞DNA残留，显示了更高的灵敏度，并且该方法拥有较好的检测精密度和准确度。

许多蛋白质类药物如胰岛素等是在酵母细胞中制备的，然而宿主细胞产生的DNA杂质对患者用药构成安全隐患，各国监管机构对蛋白质类药物中DNA杂质的限量要求及其严格。大多数生物类药物厂商将蛋白质药物中宿主细胞残留DNA的标准定在每毫克药物≤1.0 pg。因此，使用一种非常灵敏的DNA检测和定量方法十分重要。

将Merck公司生产的蛋白质类药物人重组IgG-Fc（RP-1）药物和Sigma公司制备的胰岛素配置成50 mg/mL的溶液，这两种生物药的宿主细胞均是酵母细胞，毕赤酵母总DNA在缓冲液中配制成31 μg/mL。直接将RP-1和胰岛素加入到数字PCR反应体系当中，每个反应体系包含11 μL 2x Supermix、2.2 μL 10x引物和探针、8.8 μL的水做阴性对照或3.3 μL毕赤酵母DNA和5.5 μL的蛋白质药物（或者水）。随后将体系分割成纳米级的微滴，进行PCR扩增，然后检测荧光信号并对药物中酵母细胞残留DNA进行定量分析。

DNA Std (fg)：

酵母细胞DNA量，6000、600、60、6、0 fg

DNA Std+RP-1：

酵母细胞DNA加25 μg RP-1

DNA Std+Insulin：

酵母细胞DNA加50 μg 胰岛素

图1

数字PCR检测RP-1和胰岛素中毕赤酵母细胞残留DNA线性范围

2. 数字PCR作为一种精确、灵敏的检测方法，无需DNA标准曲线，可以直接定量检测RP-1和胰岛素生物药中酵母细胞残留DNA。

3. 该方法同样适用于其他生物药中宿主细胞DNA残留检测。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0731708516300504