新羿数字PCR：更灵敏更准确的肺癌液体活检技术

摘要

2020年7月6日，北京大学国际医院，解放军总医院第五医学中心，北京天坛医院以及清华大学的联合团队在国际临床化学和实验室医学协会的官方杂志《Clinica Chimica Acta》发表了题为“Establishment and validation of a novel droplet digital PCR assay for ultrasensitive detection and dynamic monitoring of EGFR mutations in peripheral blood samples of non-small-cell lung cancer patients”的研究论文。该研究采用新羿TD-1数字PCR平台，比较了微滴数字PCR与传统的ARMS方法在检测非小细胞肺癌患者血浆EGFR突变中的应用，并且分析了血浆EGFR突变丰度的动态变化与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）疗效的相关性，为数字PCR在临床阶段的合理应用提供了进一步的建议。

研究背景

肺癌是死亡率最高的恶性肿瘤，其中约80%是非小细胞肺癌（NSCLC）。表皮生长因子受体（EGFR）是NSCLC最为常见的驱动基因，其中18-21号外显子上的突变对于酪氨酸激酶抑制剂的使用有重要的指导价值，是NSCLC患者的常规检测项目。虽然组织标本是EGFR突变检测的首选，但是多数患者很难提供足量的组织标本用于初诊和后续的动态检测。在这种情况之下，血浆标本之中的游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）成为了一种可选择的样本来源。但是外周血之中肿瘤来源DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的含量非常少，这为检测方法的敏感性提出了极高的要求。数字PCR具有超高敏感性以及能够进行绝对定量的特点，在EGFR的血浆检测中具有良好的应用前景，但是目前还缺乏经过健康监管部门批准的标准方法，而且在临床之中的合理应用也有待进一步的探索。

方法与结果

该研究首先采用参考品对新建立的数字PCR方法的性能进行了评价，获得了4个不同野生型DNA载量（200，1,000，3,000和15,000拷贝）下的空白检测限（limit of blank，LoB），并用突变DNA梯度稀释测试，结果证实数字PCR的敏感性可以达到0.1%的突变率。

之后，将数字PCR方法应用于NSCLC患者的血浆cfDNA样品的检测，共计入组了77例患者，其中50例为EGFR状态未知的测试组，通过与Super-ARMS检测结果的比较来确定判读的阈值；另外27例为常规检测已知EGFR突变的验证组，用于验证阈值的可靠性。研究发现患者的cfDNA总拷贝数整体偏低（超过70%的患者低于1000个拷贝）且高度可变（范围为1.6-38725拷贝之间），提示在制定判读阈值的时候需要考虑总拷贝数的因素。

结合上述结果以及测试组患者的Super-ARMS检测结果，研究者制定了用于患者检测的判读阈值：当cfDNA总拷贝数≥1000时，突变率≥0.1%；当cfDNA总拷贝数<1000时，至少检测到1个突变拷贝。此外，由于过低的输入DNA将会造成采样偏差，导致假阴性结果的产生，因此研究者建议设立一个总拷贝数的置信区间（≥200），低于该区间的样品，建议进行重新采样或者进行预扩增之后再进行数字PCR检测。

采用上述判读标准，在验证组，测试组以及所有患者中均证实数字PCR方法具有更高的检出率和敏感性。

所有患者

对于测试组中数字PCR检测结果为阳性的患者，对其随访点上的样品进行了动态的检测，并将该结果与患者临床治疗的相关性进行了分析。证实在TKI治疗期间EGFR突变丰度的增加与降低分别与耐药和有效相关，而在化疗期间突变丰度的反弹，可能提示了再次使用TKI药物的理想时机。

意义与前景

1）本研究采用的新羿TD-1数字PCR平台，是具有我国独立知识产权的产品，自动化的仪器操作保证了微滴生成和检测过程中的稳定性和可比性，独立管路和封闭操作的芯片则尽可能避免了气溶胶污染的可能性。基于上述优势，该平台有望在未来通过审批并应用于临床常规检测。

2）数字PCR在超高敏感性和绝对定量方面具有明显的优势，非常适合血液标本的定性突变分析和定量动态监测，对于TKI药物的使用时机选择以及疗效的动态评价等方面都具有重要的指导价值。本研究在判读标准以及疗效分析方面所做的尝试具有一定的借鉴意义。

作者介绍

共同第一作者：汤传昊，祝令香，张丽娟

共同通讯作者：李晓燕，郭永，刘毅

全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0009898120303193