dPCR用于肺癌ALK基因检测研究，J. Cancer Res. Clin. Onc., 2020

发表文献网址： https://doi.org/10.1007/s00432-020-03166-1

摘要

2020年3月3日， 北京协和医院病理科曾瑄教授团队在《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》发表题为 “ALK detection in lung cancer: identification of atypical and cryptic ALK rearrangements using an optimal algorithm” 的研究论文，该研究使用新羿TD-1数字PCR平台，采取融合诱导的不平衡转录分析（Fusion-induced asymmetric transcription assay， FIATA）策略，比较了逆转录微液滴数字PCR（RT-ddPCR）法与IHC和FISH在非小细胞肺癌ALK融合检测中的优势，并提出了更优化的临床ALK检测策略。

研究背景

间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因融合变异是非小细胞肺癌（NSCLC）中的一类重要驱动突变，突变率5-7％。ALK基因的常见融合伴侣是棘皮动物微管相关蛋白4（EML4），近年还发现了其他较少见的融合伴侣基因，如TFG，KIF5B，HIP1和KLC1等。大约80％的ALK融合变异为EML4–ALK融合，20％为ALK与其他伴侣基因的融合。NSCLC的ALK融合变异对crizotinib，ceritinib，alectinib，brigatinib和lorlatinib等ALK抑制剂表现出良好的响应性。因此，对ALK融合变异状态的准确评估对于NSCLC的治疗至关重要。

方法与结果

研究选取了182例石蜡组织（FFPE）标本，分别用RT-ddPCR、IHC和FISH方法检测，对三种方法不一致或异常的标本用NGS、RT-PCR或RNA原位杂交（RNAscope）法进行验证。检测结果发现，RT-ddPCR法检测出63例ALK阳性标本，IHC和FISH法各检测出62例ALK阳性标本，经过对不一致标本进行验证，RT-ddPCR结果全部正确，IHC和FISH各有1例假阴性。RT-ddPCR还发现了2例标本中ALK表达模式异常，经验证发现1例标本中存在罕见的融合异质性，标本中同时有EML4-ALK (E7:E14)和DGKI-ALK (E29:E16)，结果如下图：

检测ALK基因5′端RNA低表达情况，使用新羿dPCR平台，可以检出低至5′端1.6拷贝RNA表达量，验证5′端低表达情况。

5例结果不一致或异常的标本验证结果如下表：

基于以上结果，研究者认为：

1）三种方法没有发现假阳性，而IHC和FISH都存在假阴性，所以在临床实践中更应关注假阴性问题。

2）临床实践中，IHC阴性标本往往不会用FISH或NGS复核，导致假阴性患者失去靶向治疗机会， 而RT-ddPCR可以最大限度减少假阴性。

3）FISH检测会受主观因素影响，有部分标本因判读困难而导致漏检，结果不如RT-ddPCR客观。

4）NGS方法也会有一定比例的假阴性，且实验流程和数据分析复杂，检测周期长。

5）基于荧光定量PCR的RT-PCR法只能检测部分已知融合，也会有假阴性。

综合以上发现，研究者提出了在临床实践中更优化的ALK检测方案：如先用RT-ddPCR和IHC进行筛查，对结果不一致的标本再用FISH或NGS或RT-PCR复核。该策略的优势是准确性好，可以最大限度避免假阴性；检测时间短；性价比高。如下图：

研究结论

该研究很好体现了数字PCR技术在检测基因融合变异方面的优势，结合FIATA策略，不受融合伴侣和融合位点影响，能够准确发现导致ALK基因转录异常的基因融合，同时检测已知和未知融合变异，避免假阴性，而且实验操作简单，检测周期短，性价比高。

作者简介

刘媛媛为该论文的第一作者，曾瑄教授为论文的通讯作者。

参考文献

Liu, Y., Wu, S., Shi, X. et al. ALK detection in lung cancer: identification of atypical and cryptic ALK rearrangements using an optimal algorithm. J Cancer Res Clin Oncol (2020).
https://doi.org/10.1007/s00432-020-03166-1