“准”共聚焦微液滴数字PCR分析仪，Talanta，2020

发表文献网址： https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.120200

2019年8月1日，清华大学医学院生物医学工程系郭永实验室合作在《Talanta》在线发表题为《一种用于高精准和防污染检测的“准共聚焦”荧光流式微液滴阅读仪》（A 'Quasi' Confocal Droplet Reader Based On Laser-Induced Fluorescence (LIF) Cytometry for Highly-Sensitive and Contamination-Free Detection）的研究论文，该研究创新地采用了“准共聚焦”式检测光路和全封闭的微流控芯片，实现了微液滴数字PCR的高精准和防污染检测。

微液滴数字PCR是一种单分子水平的核酸定量分析技术。其策略是：首先将PCR反应体系分割为大量的微液滴，使得绝大多数微液滴内仅含有0个或1个模板分子（分别称为“阴性微液滴”和“阳性微液滴”）；然后经过PCR扩增反应，“阳性微液滴”呈现出较强的荧光信号，而“阴性微液滴”呈现出较弱的背景荧光信号；最后，通过微液滴内荧光的检测和分类，可以得到待测模板的拷贝数。

数字PCR的微液滴直径介于10-100 μm之间，这对传统荧光检测技术提出很高的要求。如果“阳性微液滴”与“阴性微液滴”之间的荧光信号对比度偏低，将引发“阳性微液滴”与“阴性微液滴”区分的困难和错误。与此同时，由于微液滴数字PCR具有超高的灵敏性，在PCR反应后的任何开放式操作都可能造成微液滴内容物的挥发和逸出，导致扩增产物的气溶胶污染。目前商业化微液滴数字PCR仪器多涉及PCR反应后的开放式操作，比如微液滴的吸取和转移等，这在临床应用中可能导致样本假阳性的严重后果。

为了解决上述不足，在这项研究中，研究人员采用了“准共聚焦”式荧光流式来构建微液滴阅读仪的光路（图1），其激发光路采用了新型的离焦激发模式，使得激发光斑恰好与微液滴的尺寸相匹配，最大限度地激发整个微液滴内的荧光信号，提高“阳性微液滴”与“阴性微液滴”之间的信号对比度；其荧光检测光路使用与微流道共轭的小孔来消除微流道以外的杂散光，提高荧光信号的信噪比。基于上述光路，研究人员实现了10-10,000模板拷贝的微液滴数字PCR高灵敏度检测，其相对误差小于5%，线性度r²＞0.998。

图1：微液滴阅读仪采用的“准共聚焦”荧光流式光路

与此同时，研究人员设计了新型的微流控芯片（图2），该芯片采用了一种“密封-穿刺”的结构，使用适配器（Adaptor）在管盖（Rubber cap）外侧形成更大范围的密封，使得反应管盖被刺穿时微液滴处于一个更大的密闭空间中，从而在检测过程中保持了严格的密闭，避免微液滴核酸扩增产物气溶胶的污染。基于上述芯片结构，研究人员在连续进行了7天表皮生长因子受体基因（EGFR）T790M突变位点的检测后，将6管未加任何模板的EGFR T790M反应体系暴露于微液滴阅读仪周边15分钟，以充分地吸收可能从微液滴阅读仪中逸出的气溶胶污染。微液滴数字PCR的检测结果显示，所有6管未加模板的EGFR T790M反应体系全部呈阴性结果，证明该微液滴阅读仪可有效避免微液滴数字PCR的污染。

图2：微液滴阅读仪采用的微流控芯片

该研究为微液滴数字PCR的临床应用提供了一种高灵敏和防污染的自动化检测装置。随着精准医疗的发展，开发高灵敏和防污染的单分子核酸检验和定量分析技术对于疾病的筛查、诊断、用药指导、病情监测和预后均具有重要意义。

清华大学医学院的朱修锐博士和刘宝霞博士为该论文的共同第一作者，医学院郭永研究员和精仪系荆高山博士对该研究进行了指导，北京新羿生物科技有限公司参与了合作研究。本课题得到国家自然科学基金和北京新羿生物科技有限公司横向合作课题等的经费资助。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.talanta.2019.120200 

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