防疫利器丨新冠病毒环境监测新助力-新羿dPCR解决方案

发布日期：2022-05-30

越来越多的案例和研究证明，新冠病毒可以通过气溶胶、水和物体表面进行传播，对环境样本中新冠病毒的有效监测是监控和阻断病毒传播的前提和保障。但环境样本中病毒载量低（空气和物体表面）、核酸背景复杂（动物拭子、排泄物，污水）、抑制物浓度高（排泄物，污水）等特点给检测工作带来了很大的困难。样本的合理采集、核酸的高效提取和灵敏可靠的检测方法是准确、可靠检测环境样本新冠病毒的关键。

数字PCR是一种可以精确定量的单分子检测技术，它将样品分成几万个独立的液滴，每个液滴是一个单独的PCR反应，在PCR扩增后被计为阳性或阴性。其结果是对总PCR反应中的模板拷贝数的绝对定量。与其他类型的定量PCR（qPCR）方法相比，它具有更高的灵敏度和抗抑制能力。数字PCR技术的最终结果受扩增效率影响更小，具有更高的重现性。多项研究表明，数字PCR在环境样本中病原体的检测具有明显优势。

物体表面和气溶胶新冠病毒的检测

华中农业大学的Jun Lv等人检测了新冠检测实验室中包括手套、冰箱门把手和护目镜等61种物体表面的拭子采集样本，qPCR方法全部为阴性，而dPCR法检出13个阳性样本。其中手套等个人护具上的病毒浓度最高（图1）。

图1

北京大学、南京医科大学和中国科技大学等单位的研究者检测了四家医院的44个空气样本和318个物体表面样本，其中3个空气样本和10个物体表面样本数字PCR检测为阳性，而RT-qPCR检测全部为阴性（图2），说明dPCR对低病毒载量可以实现更有效的检出。

图2

废水中新冠病毒的检测

美国Dartmouth-Hitchcock医学中心的Diana M. Toledo等对2020年9月底至2021年2月初美国新罕布什尔州和佛蒙特州的9个城市的废水样本进行了监测，结果显示废水中新冠病毒浓度比活跃病例数提前7天达到峰值。对比新冠病毒遗传标记N1、N2的检测结果，数字PCR的阳性检出率要高于qPCR（表1），两种标记物的线性相关关系也高于qPCR（图3）。

表1

图3

环境样本新冠病毒检测流程

样本采集—空气样本

将气溶胶采样器放置在合适的位置，一般情况下采样器进气口距离地面高度建议为 1.2 m～1.5 m。打开气溶胶采样器采集空气样本30分钟，收集液用0.45 μm尼龙膜过滤后再用20 nm滤膜过滤。滤膜取出切成小块后放入2 mL离心管，离心管中加入500 μL水或者缓冲液，漩涡震荡后离心取上清进行核酸提取。

样本采集—物体表面样本

用采样拭子反复擦拭物体表面2-3次，将拭子放入样本保存管，折断拭子头使之完全浸入保存液。取500 μl病毒保存液进行核酸提取。

气溶胶样本和物体表面样本的采集请参考国家卫生行业标准《农贸（集贸）市场新型冠状病毒环境监测技术规范》（WS/T 776—2021），或江苏省地方标准《新型冠状病毒检测技术规范》第7部分：空气样本检测与评估和第8部分：物体表面检测与评估。

样本采集—污水样本

50–500 mL 污水10,000 xg离心10分钟，上清液用0.45 μm尼龙膜过滤后再用20 nm滤膜过滤。滤膜取出切成小块后放入2 mL离心管，离心管中加入500 μL水或者缓冲液，漩涡震荡后离心取上清进行核酸提取。此外，污水样品中新冠病毒的富集还可以采用“聚乙二醇沉淀法”和“铝盐混凝沉淀法”，具体操作请见《污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》（WS/T 799—2022）。

核酸提取

配套新羿生物专属的高效病毒提取仪器和试剂，进行全自动核酸提取纯化。

dPCR检测

整个检测过程分为液滴制备、PCR扩增和检测分析三步，操作简单，会基本移液器操作即可胜任。新羿生物TD-1 数字 PCR 平台检测系统具有独特的四重防污染设计，能有效减少扩增过程中产生的气溶胶污染，避免出现因气溶胶污染导致的假阳性结果。

数字PCR法作为一个辅助检测方法，在我国已经应用于农贸市场和大型体育场馆的物体表面和气溶胶中新冠病毒检测，为新冠防控提供了有力依据。

新羿生物作为国内数字PCR领域的领先者，拥有数字PCR平台从仪器到耗材、试剂的研发和生产能力。独立研发的“新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）”是国内首个获得NMPA认证的基于数字PCR的新冠核酸检测试剂盒。2021年12月，新羿生物协助江苏省疾控中心起草并发布了全国首个数字PCR检测新型冠状病毒技术规范地方标准：《新型冠状病毒检测技术规范 第 16 部分：核酸数字 PCR 法》，结束了数字PCR技术没有标准的时代，标志着数字PCR诊断流程与规范的工作取得了阶段性胜利，加速了数字PCR技术在一线的推广使用，对数字PCR在临床检测领域的发展具有里程碑意义。

“新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）”的最低检测限为100拷贝/mL，优于qPCR检测试剂盒，大大增加阳性检出率。此外，试剂盒与常见呼吸道病毒、呼吸道致病菌和人基因组无交叉反应；包括人血、粘蛋白、二十几种药物在内的样本中可能存在的干扰物对本试剂盒无明显干扰，避免了假阴性和假阳性的出现。

此外，新羿生物还可以提供包括采样拭子、空气采集器、新冠病毒核酸提取试剂盒、全自动核酸提取仪等产品，为新冠病毒的环境监测提供一站式服务。

产品列表

数字PCR检测环境样本新冠病毒优势总结