综述｜数字PCR在新冠肺炎检测中的应用

摘要

2021新年伊始，光明日报报道，国际计量局近日在其网站上公布了新冠病毒核酸测量国际比对结果。比对结果表明，数字PCR法可在全世界范围内实现对新冠病毒核酸含量的高精确测量。该比对由中国计量院提出和联合主导，世界多个国家计量机构参与，有利于提高世界各国新冠病毒核酸测量结果的一致性和准确性。数字PCR，因为新冠病毒检测，走进了公众视野。

研究内容

近期，清华大学医学院生物医学工程系郭永团队在《VIEW》期刊发表了题为 “Applications of digital PCR in COVID-19 pandemic” 的综述文章。

在这篇文章中，作者介绍了数字PCR的原理和优点，综述了数字PCR在COVID-19大流行中的应用，并讨论了数字PCR在COVID-19及相关临床应用中的挑战。

基于液滴数字PCR的SARS-CoV-2检测工作流程：

数字PCR优势：

1）绝对定量：通过对反应单元的微分、终点检测和泊松分布数学模型，在不依赖标准品的前提下，可实现对靶标分子的绝对定量；

2）更高的灵敏度：对反应单元进行微分的同时，降低了每个反应单元中非靶标分子的占比，从而提高了靶标分子的扩增效率和检测灵敏度，对一些稀有突变的检出率可以提高到0.001%；

3）更好的稳定性：微分反应单元的同时也对PCR反应抑制剂进行了稀释，因此数字PCR显示出比荧光定量PCR（qPCR）更好的抑制剂耐受性，可以在复杂样品的检测中实现更好的检出；

4）更高的精度：在区分更细微的拷贝数差异时，与qPCR相比，数字PCR表现出更好的区分能力，结果具有更小的变异系数（CV值）。

数字PCR，在COVID-19诊断和治疗中发挥重要的作用：

1）对SARS-CoV-2的高敏检测：尽管逆转录荧光定量PCR（RT-qPCR）方法是目前COVID-19诊断的金标准，但其被报道存在假阴性率高的问题，而数字PCR的检测限（LoD）比RT-qPCR更低，在一些临床样本的检出中，数字PCR检测结果跟临床诊断的结果一致性比RT-qPCR更好，因此对于低病毒载量样品的检测，数字PCR可作为RT-qPCR的重要补充。

2）评估不同类型的临床样本的病毒载量：COVID-19测试可使用多种类型的临床样品，包括鼻拭子、咽拭子、痰液、血液、尿液、粪便和支气管肺泡灌洗液等，选择合适的样本类型对于准确的临床诊断至关重要。数字PCR可对上述样本中的病毒载量进行定量，Yu等人的研究发现，痰液中病毒载量最高，其次是鼻拭子和咽拭子，提示了使用痰液和鼻咽拭子作为测试样本能够增加阳性检出率。

3）样本制备方法评估：安全处理疑似COVID-19病例的样本对于保护医学实验室人员免受感染伤害至关重要。Chen等人使用数字PCR定量三种灭活方法处理前后样本中的病毒量，结果表明灭活处理会降低可检测的病毒RNA的数量，可能导致假阴性结果；而且相比热灭活，使用TRIzol试剂灭活对病毒RNA的影响最小。这项研究表明，数字PCR可作为评估核酸样本预处理效果的有效方法。

4）动态监测疾病进展：在临床管理和治疗中，密切监视病人的病情进展非常重要。对于大多数病毒感染引起的疾病，病毒载量越高，疾病病情越重。因此，研究病毒载量与COVID-19严重程度之间的关系非常重要，数字PCR的高灵敏和高精度使其能够监测患者病毒载量的变化。Yu等使用了数字PCR来定量检测样本中的病毒载量，结果显示患者在整个疾病过程中的不同时间点病毒载量有差异，疾病早期和进展期的病毒载量明显高于恢复期，说明动态监测病毒载量变化有助于评估疾病的进展。

5）核酸参考品的制备：数字PCR可以对核酸进行绝对定量，因此，它已被用于标定核酸参考物质。例如，van Kasteren等用数字PCR定量SARS-CoV-2的拷贝数，用于制备标准物质，并将RNA进行梯度稀释以评估不同RT-qPCR试剂盒的分析性能。Fung等用数字PCR检测阳性患者样本中的病毒载量并准备了系列梯度稀释液，以确定7种SARS-CoV-2检测方法的LoD。因此，数字PCR可为国家机构，例如国家食品药品监督管理局、中国计量科学研究院或者企业单位制备SARS-CoV-2核酸标准品提供可靠方法。

6）监测环境中病毒浓度：对公共环境中存在的病毒进行监测是新冠预防和控制的重要环节，Liu等使用数字PCR检测新冠爆发期间武汉两家医院不同区域气溶胶中的病毒RNA，发现在大多数情况下无法在公共区域检测到SARS-CoV-2 RNA；气溶胶中病毒RNA的浓度在隔离病房和通风病房较低，但是在病人及医疗工作人员使用的厕所区域较高，根据这些结果，他们认为SARS-CoV-2可能通过气溶胶传播。Lv等使用RT-qPCR和数字PCR检测残留在实验室相关物体表面的病毒，例如样品运输和接待相关设施、测试仪器和个人防护设备等。RT-qPCR检测结果显示所有样本均为阴性，而61个样本中 数字PCR检测出13份样本为阳性；SARS-CoV-2 RNA密度最高的是处理病毒样本的实验室人员的手套外侧。这些研究表明，数字PCR可以监测在不同的环境中病毒RNA，为疾病预防和消毒策略提供依据。

7）SARS-CoV-2突变的检测：RNA病毒具有很高的突变率，这与毒力和进化能力相关。病毒突变研究对于评估病毒耐药性、了解与免疫有关的逃逸机制和发病机理至关重要。Wong等开发了基于数字PCR的检测方法来检测Vero-E6传播的分离株、人类类器官、实验感染的仓鼠和COVID-19患者样本中的PRRA位点或位点上游缺失变异；PRRA缺失的蝙蝠状冠状病毒变异体可以在COVID-19患者中自然存在，而且仍然可以传播，但这些变异在自然感染中的频率较低，表明它们的竞争性不如插入PRRA的野生型。这项研究表明数字PCR适用于检测已知的SARS-CoV-2突变，尤其是针对一些低频突变的检测。

8）抗SARS-CoV-2病毒药物的评估：病毒载量的减少是抗病毒药的有效性的重要指标，例如，在瑞德西韦针对成人重症COVID-19患者的一项研究中， Wang等监测了受试者呼吸道标本的病毒载量，以确定药物是否可以加速病毒载量的下降或降低病毒检出率；此外，Zhu等人监测了患者的病毒载量变化来评估阿比多尔和洛匹那韦/利托那韦治疗COVID-19的治疗效果。其中Wang等人通过标准曲线确定病毒载量，Zhu等人仅使用Ct值来表现病毒载量的变化。由于数字PCR能够实现不依赖标准曲线的绝对定量，而且能够检测到拷贝数的微小差异，作者认为数字PCR比RT-qPCR更适合用于评价抗SARS-CoV-2药物的有效性，能够给出更具说服力和准确的评价结果。

总结：

作为一种新兴的绝对定量技术，数字PCR对低丰度DNA更加灵敏和特异，能够绝对定量，对扩增抑制剂的抗性更强。数字PCR的技术优势在SARS-CoV-2的核酸检测中得到了完整的体现，在低拷贝病毒样本检测、临床样本病毒载量定量、参考品制备、环境中病毒浓度定量、病毒突变检测和药物评价等多方面扮演了重要的角色。

在临床检测中，数字PCR仍有进步空间：

1）通量：数字PCR系统的样品检测通量需要进一步提高，以满足COVID-19大规模筛查的需求；

2）自动化：需要操作流程更简单、自动化程度更高的数字PCR系统来简化复杂的操作过程，减少手动操作时间；

3）成本：需要进一步降低仪器及试剂耗材的成本，提高市场竞争力；

4）标准及批文：需要制定国家或行业统一标准，推出商品化的室内质控品；多中心评估：基于数字PCR的SARS-CoV-2核酸检测试剂盒需要经过多中心性能评估测试、获得相关监管部门批准（FDA/NMPA等），才能为临床诊断提供合规依据。

新羿生物新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸定量检测解决方案

面对新冠疫情，新羿生物充分发挥科技优势，其团队凭借丰富的重大疾病诊断技术研究经验，春节无休开发出高灵敏度的新冠核酸检测试剂盒，提供了新冠病毒精准诊断的利器。

新羿TD-1数字PCR平台

新冠病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒

新羿生物新冠解决方案特点

1. 灵敏度高：最低检测下限100 copies/mL；

2. 定量准确：无需标准品和标准曲线；

3. 通量较高：一次PCR可以完成96样本；

4. 操作简便：一步上样，操作简单；

5. 封闭检测：全封闭体系检测，可防止气溶胶污染，预防假阳性；

6. 特异性好：与其他常见呼吸道病原体（病毒、细菌、真菌）无交叉反应。

论文链接：DOI: 10.1002/VIW.20200082

光明日报文章链接：https://wap.gmdaily.cn/article/72e29daab67141d3be5f2706aca00a1a?from=singlemessage

参考文献：（略）