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新羿数字PCR平台助力mRNA疫苗工艺质控

发布日期:2022-06-17

mRNA由DNA作为模板转录而来,其携带的遗传讯息指导蛋白质的合成。mRNA疫苗通过修饰病原微生物中特异性的靶标蛋白mRNA序列,再将其包裹进载体中注射入人体,在人体细胞内mRNA翻译为靶标蛋白,最终诱导人体产生免疫反应。随着新冠病毒的爆发及全球流行,mRNA疫苗因其研发时间短、生产速度快及成本低、对抗变异病毒的效率高及可诱导较强的免疫反应等优点,在疫情控制方面发挥了排头兵的作用,同时mRNA疫苗技术在此次新冠疫情中也得到了较大的提升。mRNA疫苗的优势使其成为未来对抗传染病的一个有希望的方案,基于mRNA的其他产品也被期望在癌症的临床治疗中发挥重要作用。


Aldosari et al., (2021). Lipid Nanoparticles as Delivery Systems for RNA-Based Vaccines. Pharmaceutics, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13020206.


在mRNA疫苗技术快速发展的同时,关于指导mRNA质量非专有方面的监管指南和行业标准也在不断发展。mRNA疫苗研发和生产中宿主细胞DNA残留和mRNA质量监测至关重要,需要使用敏感且能够精准定量的检测方法为疫苗安全生产把关。

USP指南草案推荐数字PCR进行mRNA疫苗定量分析检测


美国药典(USP)于2022年2月23日发布了题为“mRNA疫苗质量分析方法”的指南草案,草案中推荐了纯化mRNA原料药的鉴别、含量、物理状态(完整性)、纯度和安全性的质量评估方法,便于考察mRNA原料药相关的质量属性。USP中指出可以使用数字PCR(dPCR)对mRNA进行定量,无需标准曲线。dPCR平台的检测步骤为先将mRNA反转录为cDNA,将反应体系分割为多个反应单元后进行PCR扩增,PCR反应结束后采集各个反应单元的荧光信号进行分析,从而实现对单份样本中核酸物质的定量检测。定量过程中不需要标准品即可绝对定量,实现单份样品更高的检测灵敏度,使定量分析达到一个全新的水平。


表1.mRNA原料的质量属性-USP



新羿生物的4×RT-dPCR mix 试剂盒以mRNA为模板,搭配新羿自主研发的数字PCR平台,同时完成逆转录和扩增步骤,可以高效、特异、灵敏地定量检测mRNA靶分子。探针涵盖多种mRNA靶序列,也可以用于检测基因表达水平的微小变化。


《药典》规定需对宿主细胞残留DNA精准定量

mRNA原液生产工艺一般分为两个阶段,即DNA转录模板的制备和mRNA的制备。DNA转录模板是通过构建靶标基因DNA序列的克隆质粒,然后将质粒转化至宿主菌中进行扩繁,再抽提获得大量的携带靶标DNA序列的质粒进行酶切获得。在质粒DNA抽提过程中残留的宿主细胞DNA会显著影响体外转录反应和转录mRNA的质量。其他生物制品中宿主细胞DNA残留也会存在一定的风险,如病毒性疫苗中宿主细胞残留DNA相关的风险主要是感染性和致癌性,如果存在逆转录病毒前病毒,其基因会整合入受者基因组可能导致感染;如果存在病毒或传代细胞基质中的致癌基因,则可能具有引发肿瘤的潜在风险。综上所述必须对残留的DNA进行监测,以确保DNA模板的纯度和安全性。


建立合适的宿主残留DNA的检测方法对监测生物制品的安全性和质量可控性至关重要。近几年,国内外各类监管机构出台了生物制品中可接受的宿主细胞残留DNA水平的指导方针。我国《药典》第三部对生物制品的相关规定也指出,应对半成品中残留外源性DNA含量进行检测,每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。各国药典也陆续提供了数种检测宿主细胞残留DNA的经典方法,包括阈值法、杂交法及实时定量PCR,但是传统的检测方法存在有弊端。目前,基于实时荧光定量PCR(qPCR)的方法被广泛应用于宿主细胞残留DNA的定量,但是qPCR的检测结果与真实的残留DNA含量有很大差异性,检测重复性不好,并且qPCR定量依赖于标准品,只能进行相对定量,已渐渐不能满足产品生产与质量控制的要求。区别于qPCR对扩增循环数进行相对定量的方法,dPCR技术是根据泊松分布原理及阴性、阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度,dPCR可以实现绝对定量,具有更高的灵敏度、重复性和准确性。


新羿的Probe dPCR SuperMix结合数字PCR平台对宿主细胞DNA残留进行精准定量,实验操作简便、数据分析容易、结果明了,具有广泛应用前景的方法。Probe dPCR Multiplex Supermix在通用试剂基础上进行优化升级,可大幅度提升多重数字PCR的性能,4x浓缩液可加入更大样本量,提高灵敏度,增加微滴群区分度,减少体系优化步骤。Probe dPCR Faster Supermix搭载快速PCR程序进行高效的数字PCR检测,可缩短变性及退火延伸时间、提高变温速率,30-60分钟内完成微液滴式的扩增反应,提升单位时间内的样本检测通量。

表2.推荐产品目录



数字PCR优势总结


无需标准曲线的绝对定量 ( DNA / mRNA / miRNA / LncRNA )
提高对抑制物的耐受程度 (克服抑制物对定量结果的干扰)
更高的检测灵敏度 (提升高丰度野生型背景下的<0.1%突变检出率)
更高的数据精确性 (能识别1.1倍以内的浓度变化)
更好的数据重复性 (对靶标核酸含量的连续监测、横向比较)


新羿微滴式数字PCR系统在PCR扩增前把常规的PCR的反应体系微滴化,形成数万个纳升级的油包水微滴,这种微滴化的处理,使得每个微滴中的背景DNA或抑制剂能有效的降低,从而提高了扩增的特异性及检测的灵敏度。新羿生物作为国内数字PCR领域的领先者,拥有数字PCR平台从仪器到耗材、试剂的研发和生产能力。